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引物設計原則是：

　　1、引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大于38bp。

　　2、引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近。

　　3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到 3’的下降形狀也有利于引物與模板的結(jié)合。

　　4、ΔG值（自由能）反應了引物與模板結(jié)合的強弱程度，3'端的ΔG值相對要低，且絕對值不要超過9，否則不利于正確引發(fā)反應，3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時，PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40%，-8時少于20%，-10時接近于0。

　　5、錯配率一般不要超過100，否則會出現(xiàn)非目的條帶。但對于某些特定的模板序列，還應結(jié)合比較其在正確位點的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發(fā)效率為340以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為110，并且不好找到其他更合適的引物，那么這對引物是可以接受的。

　　6、Frq曲線為Oligo6軟件新引進的一個指標，解釋了序列片段存在的重復幾率大小，選取引物時，應該用Frq值相對較低的片段。

　　7、引物二聚體及發(fā)卡結(jié)構(gòu)的能量的絕對值一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體而且會降低引物濃度從而導致PCR不能正常發(fā)生。

　　8、3'端最好不要是連續(xù)堿基，GGG或CCC會導致錯誤的引發(fā)，同時3'端最后一個堿基最好不要是A或T，若是，會導致錯配。

　　9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5計算Tm值，也就是退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應的退火溫度，最好保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范圍內(nèi)。

　　10、模板與穩(wěn)定性較小的引物之間的Tm的差異越小，PCR的效率越高。因為解鏈溫度也取決于它的長度，如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500bp，選用端的引物（16-18bp），如果產(chǎn)物長5kb，則用24bp的引物。

　　11、在DNA測序和PCR中最好用5'末端穩(wěn)定（GC含量多），而3'端不穩(wěn)定（AT含量多）的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應。

　　12、引物和產(chǎn)物之間的Tm值相差別太大，20攝氏度范圍內(nèi)最好。

　　13、對引物的修飾一般在5'端進行，例如加酶切位點，加酶切位點的同時要根據(jù)需要添加保護堿基。